高解像度蛍光顕微鏡 17.10.2014

細胞とその内容物を見るには、顕微鏡が必要です。 その動作原理は比較的単純です。光線が物体を通過してから拡大レンズに入り、細胞とその内部の細胞小器官 (核やミトコンドリアなど) の両方を見ることができます。

しかし、タンパク質や DNA 分子を見たい場合、またはリボソームやウイルス粒子のような大きな超分子複合体を見たい場合は、通常の光学顕微鏡は役に立ちません。 1873 年、ドイツの物理学者エルンスト アッベは、光学顕微鏡の能力を制限する公式を導き出しました。つまり、可視光の波長の半分、つまり 0,2 未満の物体を見ることは不可能であることが判明しました。マイクロメートル。

解決策は、明らかに、可視光を置き換えることができるものを選択することです. 電子ビームを使用すると、電子顕微鏡が得られます。その中でウイルスやタンパク質分子を観察できますが、電子顕微鏡で観察されたオブジェクトは完全に不自然な状態になります。 したがって、マックスプランク協会（ドイツ）の生物物理化学研究所のステファンW.ヘルのアイデアは非常に成功したことが判明しました。

アイデアの本質は、生体分子を励起状態にするレーザービームを物体に照射できるというものでした。 この状態から、それらは通常の状態に移行し始め、光放射の形で過剰なエネルギーから解放されます。つまり、蛍光が始まり、分子が見えるようになります。 しかし、放射される波の長さは大きく異なり、目の前に不定のスポットができます。 これが起こらないようにするために、励起レーザーと一緒に、対象物を消光ビームで処理します。これにより、ナノメートルの長さの波を除くすべての波が抑制されます。 ナノメートルオーダーの波長の放射線は、ある分子を別の分子から区別することを可能にします。

この方法はSTED（誘導放出枯渇）と呼ばれ、ステファン・ヘルがノーベル賞の一部を受賞したのはこのためでした。 STED 顕微鏡法では、対象物は一度にレーザー励起によって完全に覆われるわけではありませんが、いわば XNUMX つの細い光線 (エキサイターとクエンチャー) によって引き寄せられます。画像の解像度。

STED 法はその後、XNUMX 世紀後半に現在の XNUMX 人の受賞者であるハワード ヒューズ研究所のエリック ベツィグとスタンフォード大学のウィリアム E. モアーナーによって独自に開発された、いわゆる単分子顕微鏡法によって補完されました。 蛍光に依存するほとんどの物理化学的方法では、多くの分子の全放射を一度に観察します。 ウィリアム・マーナーは、単一分子の放射を観察できる方法を提案しました。 緑色蛍光タンパク質 (GFP) の実験中に、彼は、励起波長を操作することで、その分子の発光を任意にオン/オフできることに気付きました。 さまざまな GFP 分子の蛍光をオン/オフすることで、アッベのナノメートル制限を無視して光学顕微鏡で観察することができました。 全体の画像は、視野内の異なる発光分子を含むいくつかの画像を単純に組み合わせることで取得できます。 これらのデータは、Eric Betzig のアイデアによって補足されました。Eric Betzig は、異なる光学特性 (つまり、大まかに言えば、マルチカラー) を持つタンパク質を使用して蛍光顕微鏡の解像度を高めることを提案しました。

ヘルの励起消光法と Betzig-Merner 和法を組み合わせることで、ナノメートル分解能の顕微鏡の開発が可能になりました。 その助けを借りて、オルガネラとそのフラグメントだけでなく、分子同士の相互作用も観察できます (分子が蛍光タンパク質で標識されている場合)。 この方法の価値を過大評価することはできません。なぜなら、分子間接触は分子生物学の基盤であり、それなしでは不可能だからです。現代科学技術の分野。